第一节 血清载脂蛋白定量的方法学及其参考值的评价

一、载脂蛋白测定方法

1.单向免疫扩散法(radialimmunodiffusion,RID)

该法较简单,一般实验室均可进行。消耗较多的抗血清,扩散过程至少24h,最多需72h,测定下限值为10μg/ml。该方法虽然简单,应严格控制有关条件如:含抗血清的琼脂糖凝胶厚度要均匀;加入小孔的稀释抗原(血清)量要准确;含ApoB的脂蛋白如VLDL和LDL颗粒大小不一,如琼脂糖凝胶浓度在1.5%~2.0%,可能仅测出LDL的ApoB,大颗粒的LDL及VLDL的ApoB可能无法测出,因为难以穿过琼脂糖凝胶的孔隙。另外,扩散过程中,凝胶板一定要水平,否则易使扩散环呈椭圆形,难以准确测量直径。一般使沉淀环以3.5~10.0mm为宜,应在两个方向测量直径,其精度要求达到0.1mm。采用五种不同浓度参考值,测定沉淀环面积对相应浓度关系以曲线回归方程作图。

2.电免疫测定法(electroimmunoassay,EIA)

该法灵敏,抗血清用量少,如琼脂糖缓冲液中加入聚乙二醇及甘氨酸,其电泳时间可缩短一倍,火箭峰高以1~4cm为宜,火箭峰的测量可以计算面积或峰高,峰高从中心量起。测量精度最好能在0.1mm,灵敏度约2μg/ml,又称为火箭电泳法。

3.免疫比浊法(immunoturbidimetryassay,ITA)

简便快速,在自动分析仪进行操作并能批量检测,是目前临床使用最多的方法学。免疫比浊法有两种:一是测定光散射的,又名免疫散射比浊法(INA);需用特殊的激光浊度仪;另一种是利用光度计测定通过混浊溶液后的透光强度,称为透射免疫比浊法(ITA),其灵敏度低于INA。比浊法可以终点法和速率法测定,速率法是根据散射光强度与时间的关系,以微机处理计算出抗原抗体复合物形成的最大反应速度,后者与溶液中抗原量成正比,常可在1min内完成测定过程,可自动扣除空白;终点法比速率法稳定,一般多用终点法。

4.酶联免疫法(enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)

该技术已广泛应用于极微量蛋白的定量测定,可测出ng级水平的抗原或抗体含量,该法可用于ApoE、C-Ⅱ、C-Ⅲ等含量较少的载脂蛋白的定量测定。

5.放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)

该法灵敏,抗血清用量少,所需设备较多,一般用125I标记抗原作为示踪物,除ApoC-Ⅰ(不含酪氨酸)以外,都可以作碘标记(氯胺T法),以双抗体法测定RIA法可检测最低至3~5ng。临床检验中不常用此法,主要用于动物实验的科学研究工作。

还有荧光免疫法和化学发光法等灵敏度很高的方法。

血清载脂蛋白测定的方法,从测定原理、方法学评价及参考值,刘秉文和李健斋等人作了大量的工作,为国内的载脂蛋白测定的临床应用奠定了基础。周新曾于1986年首先在国内研制成功抗人ApoB100血清,其后,国内同仁陆续研制出ApoAⅠ、AⅡ、AⅣ、E、CⅡ、CⅢ抗血清,并广泛应用于临床的疾病诊断,在部分大医院已成为常规检查项目。

刘秉文在“脂蛋白与动脉粥样硬化“一书中全面总结了国内外载脂蛋白测定的方法学及其参考值,本节将引用如下比较表:

表18-1 ApoAⅠ免疫测定法的比较

 RIAELISAEIARIDINAITA
抗体P,MP,MPP,MPP
灵敏度(n)0.3~100.1~0.5100100150100
测定范围(ng)1~2000.5~15100~500200~800200~500200~600
批内CV(%)3~94~83~563~71
批间CV(%)5~108~103~9106~76
正常值(g/L)1.0±0.21.5±0.21.2±0.21.2±0.11.2±0.21.7±0.2

P:多克隆抗体;M:单克隆抗体;RIA:放射免疫法;ELISA;酶联免疫法;RID:单向免疫扩散法;INA:免疫散射比浊法;ITA:免疫透射比浊法。

(源自:刘秉文,1995.)

表18-2 ApoAⅡ免疫测定法的比较

 RIAELISAEIARIDINAITA
抗体PP,MPPPP
灵敏度(g)0.5 2053020
测定范围(ng)1~205~5030~6050~40050~90040~150
批内CV(%)785555
批间CV(%)978-76
正常值(g/L)0.25±0.40.35±0.050.76±0.20.29±0.020.37±0.090.36±0.03

(源自:刘秉文,1995.)

表18-3 ApoAⅣ免疫测定法的比较

 RIAELISAEIA
抗体PPP
灵敏度(g)50.220
测定范围(ng)5~500.5~850~200
批内CV(%)53.605
批间CV(%)789
正常值(g/L)0.17±0.030.14±0.050.14±0.04

(源自:刘秉文,1995.)

表18-4 ApoB100免疫测定法的比较

 RIAELISAEIARIDINAITA
抗体P,MP,MPP,MPP
灵敏度(n)5~102~2050~300300300300
测定范围(ng)0~1002~1020~50050~600300~500100~500
批内CV(%)4~84~71~73~74~72
批间CV(%)7~11103~106~77~82
正常值(g/L)0.9±0.20.85±0.10.6±0.30.8±0.20.8±0.20.8±0.3

(源自:刘秉文,1995.)

表18-5 ApoCⅠ免疫测定法的比较

 RIAELISAINA
抗体PPP
灵敏度(n)1550
测定范围(ng)5~3015~100-
批内CV(%)735
批间CV(%)958
正常值(g/L)0.05±0.030.06±0.0020.06±0.01

(源自:刘秉文,1995.)

表18-6 ApoCⅡ免疫测定法的比较

 RIAELISAEIARIDITA
抗体PPPPP
灵敏度(g)100.3454010
测定范围(ng)10~800.5~570~60040~60012~50
批内CV(%)636.52.13.3
批间CV(%)1088.23.96.2
正常值(g/L)0.04±0.010.033±0.0080.04±0.0020.039±0.0170.04±0.01

(源自:刘秉文,1995.)

表18-7 ApoCⅢ免疫测定法的比较

 RIAELISAEIARIDINAITA
抗体PPPPPP
灵敏度(g)10.310762015
测定范围(ng)2~201~620~8076~60050~40030~120
批内CV(%)134.382.56.35.2
批间CV(%)134.383.56.35.2
正常值(g/L)0.15±0.060.16±0.030.12±0.040.127±0.0370.12±0.030.11±0.03

(源自:刘秉文,1995.)

二、人血浆(清)载脂蛋白参考值比较

刘秉文于1995年对国人血浆(清)各项载脂蛋白参考值与国外参考值作了详细的比较,其报道见表18-9、18-10、18-11、18-12、18-13、18-14、18-15。

表18-8 ApoE免疫测定法的比较

 RIAELISAEIARIDITA
抗体PP,MPPP
灵敏度(n)0.2~80.520355
测定范围(ng)0.8~1000.5~620~20050~30020~400
批内CV(%)6485.92
批间CV(%)9857.25
正常值(g/L)0.05±0.020.04±0.010.10±0.040.035±0.010.04±0.01

(源自:刘秉文,1995.)

表18-9 国人血浆ApoAⅠ含量与国外报道的比较

作者发表时间方法例数性别年龄均值±s(mg/dl)
张祖辉1998RID30720-77122.1±13.7
刘秉文  31820-77125.5±15.9
李键斋等1986EIA291男+女19-50119±17
周新等*1990EIA69213-85129.1±16.1
 47718-80130.5±14.2
Albers等1976RID20男+女11.5±7.3115.7±7.3
Cheung等1977RID17220-65120±20
18820-65135±25
Reman等1978RID9540-49137±23
10440-49137±23 
Schonfelcl等1974RIA4113-58100±35
3416-58104±34 
Karlin等19762320-39130±3
1920-39154±6 
Avogaro等1978EIA6020-60128±22
6020-60134±20 
Mordasini等1980EIA5020-60113±9
5020-60125±17 
Miller等1980EIA834-70122±27
852-68149±20 
Rosseneu等1981IAN1229139±15
1430147±24 
Assmann等1982INA303220-65136±23
136720-60146±25 

(源自:刘秉文,1995)

*:作者补充。

表18-10 国人血浆ApoAⅡ含量与国外报道的比较

作者发表时间方法例数性别均值±s(mg/dl)
罗静聪1988RID76男+女26.7±4.6
刘秉文1988ELISA41男+女24.2±5.9
胡维诚1987RID160男+女27.0±4.4
Curry等1976RID1978.0±1.7
   1983.0±25
Cheung等1977RID17233.0±5
   18836.0±6
Assmann等1977EIA1534.1±5
   1538.3±5.5
Schonfeld等1977RLA29男+女40.5±8.9
Maupovic等1981ELA50男+女68.0±18
Goldberg等1980RIA5025.0±1
   5026.0±1
De Backnev等1982INA70男+女43.0±6.9
Zech等1983RID27男+女24.0±0.6
Noma等1983RLA27男+女32.0±8.3
Nukita等1984EIA156男+女40.0±9

(源自:刘秉文,1995)

表18-11 国人血浆ApoB含量与国外报道的比较

作 者发表时间方法例数性别均值±s(mg/dl)
周新等1986EIA60883.2±13.9
   51180.4±13.4
李健斋等1986EIA727男+女76±19
吴兆丰、刘秉文1987RID30487.9±14.4
   32086.7±14.4
Albers等1975RIA349男+女81.0±20
Bantorich等1975RIA82男+女90.0±24
Bedford等1976RIA128男+女87.0±30
Schonfeld等1974RIA42男+女83.0±16
Brussaard等1980EIA60男+女63±16
Fruchart等1981EIA144男+女90
Curry等1978EIA3890±2.0
   3688±11
Curry等1978RID20男+女87±26
Lees等1970RID64男+女83±25
Snuderman等1975RID3182±22
Fievet等1979INA206129±31
   271120±34
Heuck等1979INA68男+女82.0±23
Rossenue等1981INA7092±13
Durrington等1976INA29男+女85±11

(源自:刘秉文,1995)

表18-12 国人血浆ApoCⅠ含量与国外报道的比较

作 者发表时间方法例数性别均值±s(mg/dl)
傅明德等1987ELISA2027.6±2.5
   2148.0±2.3
Polz等1980RID10男+女6.9±2.0
Curry等1981ELA68男+女6.0±1.5

(源自:刘秉文,1995)

表18-13 国人血浆ApoCⅡ含量与国外报道的比较

作 者发表时间方法例数性别均值±s(mg/dl)
傅明德等1987ELISA2025.2±1.9
   2414.9±1.8
范萍等1989RID67男+女3.9±1.7
Schonfeld等1979RIA93男+女3.9±1.4
Curry等1981EIA68男+女4.0±2.0
Kashyap等1977RIA32男+女5.0±0.4

(源自:刘秉文,1995)

表18-14 国人血清ApoCⅢ含量与国外报道的比较

作者发表时间方法例数性别均值±s(mg/dl)
傅明德等1988ELISA13411.6±3.6
   13512.0±3.7
范萍等1989RID67男+女12.7±3.7
刘秉文等1987IRA21男+女9.2±2.1
Schonfeld等1979RID93男+女15.4±6.2
Curry等1980ELA54男+女10.9±3.0
Kashyap等1981RIA29男+女11.1±0.9

(源自:刘秉文,1995)

表18-15 国人血浆ApoE含量与国外报道的比较

作者发表时间方法例数性别均值±s(mg/dl)
刘铭锋、刘秉文等1987ELISA42男+女3.57±1.24
刘铭锋、刘秉文等1987ELA50男+女4.70±1.18
刘铭锋、刘秉文等1992RID1163.95±0.98
   1224.00±1.32
张东升、夏辉明1991ELISA25男+女3.45±1.24
Blum等1980RIA26男+女3.6±1.3
Gregg等1984RIA12男+女4.8±1.2
Wesgraber等1984RIA 男+女5(3.5-7.0)

(源自:刘秉文,1995)

王抒、李健斋等于1996年报道283例血清各项载脂蛋白测定值及百分位数,如表18-16、18-17、18-18所示。这批数据是目前国内采用同一份标本检测脂质、脂蛋白和载脂蛋白项目最多的1次报道。除了作为参考值供临床应用外,并阐明了各项指标之间的相关性。笔者予以抄录,供参考。

表18-16 血脂与脂蛋白水平(mmol/L)

项目男(225例)女(58例)P值
TC4.87±0.735.16±0.84<0.05
TG1.27±0.661.25±0.71>0.05
HDL-C1.41±0.351.54±0.36<0.02
HDL2-C0.56±0.170.63±0.19<0.02
HDL3-C0.86±0.230.91±0.19>0.05
LDL-C2.95±0.683.13±0.12>0.05

(源自:王抒,1996)

表18-17 几项常用比值*

项 目
LDL-C/HDL-C2.21±0.722.16±0.80
HDL2-C/HDL3-C0.66±0.120.69±0.15
ApoB/ApoAⅠ0.72±0.160.74±0.17
ApoAⅠ/ApoAⅡ4.10±0.654.10±0.68
ApocⅡ/ ApoCⅢ0.39±0.120.41±0.16

男女组间无显著意义

(源自:王抒,1996)

表18-18 各项载脂蛋白测定值与百分位数

项目X±Sp5p25p50p75p95
男(225例)      
ApoAⅠ(g/L)1.42±0.171.171.301.431.511.72
ApoAⅡ(g/L)0.36±0.660.280.320.350.400.46
ApoB(g/L)1.01±0.210.720.861.001.141.38
ApoCⅠ(mg/L)53±173143506083
ApoCⅡ(mg/L)34±161324314269
ApoCⅢ(mg/L)44±172634415174
ApoE(mg/L)44±172634415174
Lp(α)(mg/L)1441252653107185382
女(58例)      
ApoAⅠ(g/L)1.45±0.141.211.341.441.551.74
ApoAⅡ(g/L)0.36±0.060.260.330.360.390.44
ApoB(g/L)1.07±0.230.710.901.081.201.49
ApoC(mg/L)53±183039516192
ApoCⅡ(mg/L)41±182028384977
ApoCⅢ(mg/L)104±405272100129184
ApoE(mg/L)51±183337485889
Lp(α)(mg/L)154±1163566117207464

国内的已有报道表明,人血清载脂蛋白参考值水平尚有一定的差异。引起这种差异的原因是多方面的,目前认为主要原因有:①检测方法与仪器不同;②试剂质量尤其是抗血清技术标准不统一;③国内尚未采用完全符合国际标准的定值血清;④人群的生活习惯及种族差异。为此对于国人的血清载脂蛋白参考值的确立,尚需付出艰辛的劳动。

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