一、Southern印迹法

Southern印迹法在鉴定LDL-R基因缺失突变中得到了广泛的应用。采用多种限制性内切酶切，以LDL-R基因片段和外显子特异性片段作探针，进行杂交，再放射自显影，对FH进行限制性酶切图谱分析，可检测FH患者的不同外显子区域不同长度的部分缺失类型。

二、PCR法和核苷酸序列分析法

采用PCR法将包括点突变的受体基因片段扩增，再经核苷酸序列分析即可发现点突变位点。影响酶切位点的点突变可经PCR扩增、特定的限制性酶切、电泳，检测出异常片段。

三、寡核苷酸探针法

本法采用的是一对寡核苷酸探针，其中一个与正常基因顺序互补，另一个与突变序列互补，因此需用到多种特异的寡核苷酸探针，是鉴定点突变的一种快速而简便的方法，当一个或二个点突变在某一特定人群中成为突变的主要原因时，就可建立这种方法对某一地区的某一主要突变进行筛查。

四、RFLP连锁分析法

限制性片段长度多态性（restriction fragment lengthpolymorphism,RFLP）是采用不同的限制性核酸内切酶酶切和多种cDNA片段探针，根据DNA多态性片段的出现，确定LDL-R基因的连锁相。

本法需进行家系分析，多态位点必须有一个以上是杂合的，并且要排除细胞减数分裂时基因重组对多态位点的影响。

五、长链PCR法

常规的PCR扩增长度不超过3kb，不适合检测大片段的受体基因缺失突变，Southern印迹法亦繁琐复杂，近年来长链PCR技术的研究为检测LDL-R开辟了新途径。下面详细介绍由周天鸿等建立的长链PCR法在检测LDL-R基因大片段缺失突型中的应用。

引物：设计5对寡核苷酸引物，见表20-6。

表20-6 PCR扩增引物序列

PCR引物	核苷酸序列
PA1	5’CAACACACTCTGTCCTGTTTTCCAG3’
PA2	5’GCCCTTGGTATCCGCAACAGAGACA3’
PB1	5’AGTCTGCATCCCTGGCCCTGCGCAG3’
PB2	5’AGGGCTCAGTCCACCGGGGAATCAC3’
PC1	5’CCAAGCCTCTTTCTCTCTCTTCGAC3’
PC2	5’CCACCCTCCGCCTTCCCGTGCTCAG3’
PD1	5’TCCATCGACGGGTCCCCTCTGACCC3’
PD2	5’AGCCCTCATCTCACCTGCGGGCCAA3’
PE1	5’AGATGAGGGCTCCTGGTGCGATGCC3’
PE2	5’GCCCTTGGTATCCGCAACAGAGACA3’

DNA：由健康人和FH患者外周血制备DNA。

长链DNA扩增：采用引物PA1和PA2扩增LDL-R基因中外显子5～10的片段。

PCR扩增制备探针：采用引物PB1/PB2、PC1/PC2、PD1/PD2、PE1/PE2制备LDL-R基因外显子7、8、9、10的同位素探针。

PA1对应于LDL-R基因外显子5的5‘端侧翼序列，PA2对应于外显子10的部分序列，此对引物扩增产物为含外显5～10的基因片段。正常人得到1条7kbDNA片段，FH患者得到2条DNA片段，一条7kb，一条4.4kb，表明FH患者是杂合子，其一个LDL-R等位基因正常，另一个等位基因外显子5～10之间存在着一个2.6kb的缺失，见图20-4。将产物用EcoR1酶切，得到的产物电泳图谱见图20-5。最后用PB、PC、PD、PE4对引物，以正常基因的长链PCR产物为模板，用PCR法获得外显子7、8、9、10的探针，将这些探针分别与正常基因的突变基因的长链PCR产物杂交，其结果见表20-7。

采用长链PCR技术可快速、简单、准确地检测大片段的缺失突变，可应用于临床基因诊断，尤其是有遗传背景的FH高危人群的基因筛查。

图20-4 FH患者LDL-R基因缺失示意图

图20-5 长链PCR产物电泳示意图

a：FH患者基因PCR扩增产物；b：健康人基因PCR扩增产物；c：CNA分子量标记。

表20-7 LDL-R突变基因和正常基因长链PCR产物与外显子7～10探针的杂交结果

长链PCR产物	探针外显子7	探针外显子8	探针外显子9	探针外显子10
突变基因	-	-	+	+
正常基因	+	+	+	+

（刘芳）