本研究旨在制备纯化的标准化、商品化抗Hp尿素酶抗体试剂盒，供临床ELISA检测用。

1　材料与方法

1.1　试剂盒的制备

Hp尿素酶抗原的分离纯化研制：①经尿素酶试验选择尿素酶活性高的经系统鉴定的Hp菌株接种于含6％脱纤维绵羊血的布氏平皿中，置微氧环境，恒温37℃培养3d收菌，脱洗、稀释后超声适度破裂，高速离心取上清液备用。②选用Sephadex G200柱（2.6×75cm柱型）在凝胶过滤成套设备中从Hp超声破碎物离心上清液中一次提纯Hp尿素酶。③将凝胶过滤后尿素活性峰与相应菌全菌蛋白上柱液及离心沉渣SDS－PAGE分析，观察尿素酶提纯效果。④Western blot（免疫印渍）分析：经SDS－PAGE将各蛋白分离后，经电泳将蛋白转移到硝酸纤维膜上，过渡、洗涤后，放入稀释的兔抗Hp阳性血清（含抗高分子量菌体相关蛋白）中，震荡、洗涤后，浸泡于稀释后的辣根过氧化酶—葡萄球菌A蛋白液洗涤后将该膜放入新配制的底物显色液中，震荡，显色，清洗，照相。

1.2　试剂盒的临床应用

研究对象：①病人：诊断按胃镜及活检病理确定。同期均检测Hp抗体。第一阶段用全菌抗原（抗Hp抗体）。男741例，女459例，年龄为18岁～77岁（42岁±10岁）。第二阶段用商品化试剂盒Hp尿素酶抗原（抗Hp－u抗体）。男1015例，女660例，年龄为16岁～74岁（45岁±7岁）。两组匹配情况相近。②献血员：以上两阶段均有健康献血员同期行Hp抗体检查，各200例。胃镜检查及活检取材：每例在距幽门5cm周径内的部位钳取粘膜标本分别送检病理组织学检查及Hp培养。组织学检查：胃镜活检标本HE染色组织学检查，Giemsa染色确认Hp存在。病理诊断参照全国胃癌防治研究协作组所订标准。炎症程度按正常、轻度、中度、重度分别判定为0、1、2、3级。细菌培养：送检用的输送培养基为10％小牛血清布氏肉汤培养基。每试管分装3ml置入2块胃镜活检组织块。每例活检钳均经消毒液浸泡15min后和酒精擦试。Hp培养基用布氏琼脂培养基为基础为基础，加入脱纤维羊血及联合抗生素、3d后观察结果，并作生化鉴定。

以上组织学与微生物学检查结果独立评价，不受临床资料暗示影响。血清ELISA法测抗HpIgG和抗HpIgG。流行因素调查：制定统一调查表逐项登记。本组共连续调查了1200例。药物治疗：212例Hp阳性胃炎患者随机分为3组。分别服诺氟沙星和胶体次枸橼酸铋（CBS，De—Nol）及安慰剂1个月。停药1月后复查胃镜及血清抗Hp抗体。

2　结果

2.1　Hp超声破碎后

Hp超声破碎后，高速离心，上清液可经SephadexG200柱将Hp尿素酶有效分离。尿素酶活性与脱洗第一峰完全一致，而第一峰中经SDS—PAGE检测只含有30kD及66kD两条蛋白带。与Hp尿素酶两个亚基的分子量一致，经Western blot分析证明第一峰蛋白仍保持了很高的抗原性。

2.2　用提纯的Hp尿素酶进行血清抗Hp尿素酶抗体测定

用提纯的Hp尿素酶进行血清抗Hp尿素酶抗体测定，经已确定的55份阳性血清标本和50份阴性血清标本对照检测，符合率100％。无假阳性及假阴性。

2.3　对1675例进行抗HpIgG抗体检测

对1675例进行抗HpIgG抗体检测。若以培养及（或）组织染色为标准，则ELISA敏感性为98％，特异性96％，阳性预测值为98％，阴性预测值为96％。抗HpIgG抗体半定量结果，本组检验以“++”为临界值标准，敏感性可达98％，特异性达96％；若以“＋”为准，则敏感性虽达99.1％，但特异性仅为84.9％。

2.4　各种商品试剂盒比较见表1。提示本组试剂盒检测Hp感染敏感性和特异性均较高。

2.5　各种胃、十二指肠疾病患者血清抗HpIgG抗体检测情况（见表1）。

2.6　流行因素调查

流行因素调查。 本组资料表明以下因素有意义：①Hp感染率随年龄增长递增，至60岁达高峰。②本组肉联厂工人（30例）与副食售货员（菜、肉组）69例抗Hp抗体阳性率分别为90.0％和86.9％，高于其他工种（P＜0.01）。③饮食习惯：喜食凉拌生菜、肉食者Hp感染率高（P＜0.05）。④家庭成员中有胃十二指肠疾病者，较无此类病者Hp感染检出率高（根据8个家庭、40名家庭成员统计）。

2.7　ELISA血清Hp抗体检测用于Hp阳性胃炎抗菌物治疗后观察抗体滴度下降（表2）。

表1　各种商品试剂盒比较

名称	抗原	观察例数	敏感性(％)	特异性(％)	阳性预测值(％)	阴性预测值(％)
Pyloriseta	全菌	68	68	76	85	62
GAP	全菌	64	98	77	86	82
Helico G	全菌	66	82	83	89	74
Bio－Rad	全菌	242	93.8	79.3	90	87
ELA－G	全菌	195	92	84	88	90
ELA－A	全菌	195	80	89	89	79
陈振侬b	尿素酶	149	92	86.5	95.4	78.1
抗Hpb	全菌	1200	94.2	84.4	93.8	90.5
抗Hpu	尿素酶	1675	98	96	98	96

^a用乳胶凝集试验，余者ELISA测定。^b非商品化试剂盒

3　讨论

本研究采用ELISA半定量检测血清抗HpIgG，经大宗病例临床检测应用，敏感性、特异性高、批内、批间差异小，稳定性强，重复性好。

表2　三组治疗前后血清抗Hp滴度　　（x±s）

	治疗前	停药后
		1月	3月	6月
诺氟沙星	700±285	176±56b	165±45b	168±89b
诺氟沙星
	694±282	167±48b	162±53b	166±49b
＋CBS
	685±286	649±282b	686±278a	676±282a
安慰剂

经自身对照：^aP＞0.05，^bP＜0.01

临床应用观察到，应用本试剂盒，在慢性胃炎、消化性溃疡、非溃疡性消化不良各类疾病中，抗HpIgG检测阳性率均很高。尤其在慢性活动性胃炎、十二指肠溃疡中检出率更高，与文献报道一致。Sobala强调血清学Hp抗体检测可用于筛查消化不良，可减少23.3％病例用胃镜检查确立Hp感染。本研究也与之相符。

应用血清Hp抗体为观察指标，来判断用抗Hp药物治疗根除Hp效果，治疗后抗体滴度下降或消失，与近几年一些报道一致。本文认为，用血清抗HpIgG追访疗效，也可减少患者接受胃镜复查Hp根除与否之痛苦。抗HpIgG检测用于流行病学研究无疑是一重要工具。